Pewernaan Atau Pengecatan Mikroba

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

            Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010)

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). 

Oleh sebab itu praktikum ini dilakukan. Pada pecobaan ini hanya ada dua cara yang kita lakukan untuk mengamati bakteri yakni pengecatan negatif dan pengecatan gram.

I.2  Tujuan Percobaan

  Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui struktur mikroba terutama pada bentuknya.

I.3  Waktu Dan Tempat Percobaan

Praktikum dilaksanakan pada hari kamis tanggal 5 januari 2012, pukul 16.00-16.30,  di laboratorium biologi dasar FMIPA universitas hasanuddin makassar.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

          Semua jenis mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan (Sutedjo, 1991).

          Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Cristhian Gram pada tahun 1844. Dengan metode ini bakeri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Micoplasma sp. (Tryana S.T,  2008).         

          Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri. Untuk membedakan berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat digunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro,1994).

          Sejumlah besar koloni bakteri dan fungi menarik perhatian oleh warnanya yang mencolok, disebabkan karena terjadi eksresi zat warna ke dalam medium atau fermentasi sel. Kemampuan membentuk zat warna terfiksasi secara genetik, dan demikian merupakan penanda khusus. Bentuk-bentuk pewarna mudah dikenal dan ditentukan identitasnya, zat warna dapat merupakan derivat dari berbagai kelas; karotenoid zat warna fenazin, zat warna pirol, azakuinon dan antosian (Hans,1994).

          Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO‑. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo,1991).

          Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO‑. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo,1991).

          Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan, oleh sebab itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras berwarna dengan sekelilingnya, sehingga akan terlihat jelas. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas bentuk dan ukuran bakteri, melihat struktur luar dan dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, serta menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas dari bakteri. Bakteri memiliki beberapa bentuk tubuh.

Menurut Volk & Wheeler (1993), Bentuk-bentuk tubuh dari bakteri yaitu:
1. Bentuk bola atau Cocci (tunggal = coccus)
2. Bentuk batang atau bacilli (tunggal = bacillus)
3. Bentuk spiral atau sprilli (tunggal = sprilum)
4. Bentuk koma atau vibrios (tunggal = vibrio)

          Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Frobisher,et all,1974)

          Satu sifat penting dari bakteri dalam hubungannya dengan mikrobiologi adalah kemampuan beberapa jenis bakeri untuk memproduksi struktur internal yaitu endospora. Endospora ini umumnya terbentuk secara tunggal dalam sel guna menanggulangi keadaan lingkungan yang kurang baik. Spora yang sudah masak dilepas oleh alam ke lingkungan sekitarnya. Spora-spora ini dapat dilihat di bawah mikroskop fase kontras dan nampak sebagai bagian yang bercahaya terang baik di dalam atau di luar sel. Spora-spora ini tahan terhadap keadaan fisik atau kimiawi yang ekstrim seperti suhu, kekeringan dan bahan-bahan kimia pembasmi kuman dan dapat bertahan dalam keadaan tidur untuk beberapa tahun. Pada saat kondisi pertumbuhan memungkinkan, spora-spora tersebut tumbuh menjadi sel-sel vegetatif normal (Buckle, 1987).

          Escherichia coli termasuk dalam  famili enterobacrericeae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentative E.coli hidup didalam jumlah besar didalam usus manusia. Yaitu membantu system pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri pathogen. Akan tetapi pada strain baru dan E.coli merupakan pathogen berbahaya dan menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yan menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air. Indicator pada level pencemaran air serta mmendeteksi pathogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella Thypi. (Library, 2008).

          Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk mikroba melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna (Menurut Waluyo, 2008).

Menurut Yulneriwanti (2008), macam-macam pewarnaan terdiri atas:

1.  Pewarnaan negatif

-          Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang

-          Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta

2.  Pewarnaan sedehana

-          Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)

-          Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel

3.   Pewarnaan diferensial

-          Menggunakan lebih dari satu macam zat warna

-          Tujuan untuk membedakan antar bakteri

-          Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam

4.   Pewarnaan khusus

-          Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll

5.   Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (filzahazny, 2008).

          Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya (Wakepedia, 2010).        

          Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah, 2006)

          Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

BAB III

METODE PERCOBAAN

III.1 Alat

          Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah : Gelas objek, Jarum ose, , Gegep, Bunsen  dan Pipet tetes

III.2 Bahan

         Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah : Isolat, tinta cina, Alkohol 70% , Tissue,  Bunsen, Biakan murni., Akuades , Larutan Hucker’s cristal violet (gram A), Larutan Mordan Lugol’s iodine (gram B), Larutan alcohol aseton (gram C) dan Larutan safranin (gram D)

III.3 Cara kerja

   Pengecatan Negatif

Ø  Semua alat dan bahan yang akan dipakai disiapkan pada saat praktikum.

Ø  Tangan dan Gelas objek dibersihkan dengan alkohol 70% agar bebas mikroba.

Ø  Gelas objek dilidah apikan.

Ø  Ose bulat dilidah apikan setelah itu tabung reaksi yang berisi isolat kemudian dilidah apikan.

Ø  Isolat diambil dengan menggunakan ose bulat lalu digoreskan pada gelas objek lalu diberikan tinta cina sampai menutupi isolat.

Ø  Dengan menggunakan objek gelas lain, sisi objek gelas disentuhkan pada sampel hingga membentuk sudut 300 kemudian objek gelas tersebut ditarik ke arah yang berlawanan hingga membentuk film tipis.

  Pengecatan Gram

Ø  Semua alat dan bahan yang akan dipakai disiapkan pada saat praktikum.

Ø  Tangan dan gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%.

Ø  Preparat olesan bakteri yang disiapkan lalu difiksasi pada pembakar spritus.

Ø  Larutan gram A diteteskan pada gelas objek sebanyak 2-3 tetes, dan dibiarkan  selama 3 menit.

Ø  Cuci dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dengan kertas (tissue) secara hati-hati.

Ø  Setelah itu, Larutan gram B diteteskan, dan didiamkan selama 1 menit.

Ø  Dicuci dengan air dan dikeringkan.

Ø  Larutan gram C diteteskan lagi kemudian dicuci dengan air dan sampai luntur dan dikeringkan.

Ø  Larutan gram D diteteskan, kemudian dibiarkan selama  30 detik.

Ø  Dicuci kembali dengan air dan dikeringkan.

Ø  Diamati  dibawah mikroskop.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

1.      Hasil Pengamatan

             Pengacatan negatif                            pengecatan gram

  

                                                                 

        Sumber Qhiqi, 2011                      Sumber Qhiqi, 2011

  Dengan latar belakang yang gelap              Bakteri negatif

2.      Pembahasan

Pengecatan  Negatif

          Pengecatan negatif bertujuan untuk melihat bakteri dengan latar belakang yang gelap dan dapat dipakai untuk mengukur bentuk dan besarnya bakteri. Selain itu pengecatan negatif merupakan metode yang cepat untuk melihat bakteri. Pada pengecatan negatif suspensi kuman dibuat dalam zat warna nigrosin/tinta cina. Dalam hal ini kuman tidak diwarnai dan tampak sebagai benda-benda terang dengan latar belakang hitam, karena dalam praktikum ini kami tidak melakukan pengamatan dibawah mikroskop maka kami tidak dapat mengetahui tata letak dan bentuk bakteri dari hasil praktikum yang telah kami lakukan.

keuntungannya adalah sel mudah dilihat karena kontras dengan latar belakangnya sedangkan kerugiannya adalah susah dilakukan karena butuh skill dan pengalaman pada waktu menggeser objek glass kedua terhadap objek glass pertama. Kalau terlalu di tekan maka catnya akan terlalu tipis, jika tidak di tekan catnya akan terlalu tebal dan pada akhirnya sulit untuk mengamati sel bakteri (Surya, 2009).

 Pewarnaan Gram

Dan pada hasil pengamatan Nampak warna merah yang menandakan bahwa preparat tersebut adalah bakteri negatif. Pada percobaan menggunakan 4 teknik pewarnaan, teknik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna.. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna.  Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk  apabila  pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri dapat terwarnai merah.

 

BAB V

PENUTUP

V.1  Kesimpulan

          Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :

ü  Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan gram, dan pengecatan negative.

ü  pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna, sedangkan pewarnaan negative berguna untuk mewarnai latar belakang preparat dan bakteri sendiri tidak terwarnai.

ü  Pada pewrnaan gram hasil yang didapat adalah bakteri gram negative karena Nampak adanya warna merah.

V.2  Saran

          Saran untuk praktikan

·         Diharapkan untuk semua praktikan agar memperhatikan dengan baik pada saat praktikum berlangsung

·         Diharapkan untuk semua praktikan agar dalam pembyatan laporan sementara diusahakan mengerjakan sendiri

·         Diharapkan  untuk semua praktikan agar terlibat dalam pembutan laporan lengkap

Saran untuk asisten

·           Keramahan asisten harus dipertahankan

·           Diharapkan agar asisten mengatur waktu yang efisien agar semua percobaan dapat terlaksanakan dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Dwi. 2010.  Pewarnaan Negatif . www.wordpress.com. Diakses pada tanggal 15 Januari 2012. Campalagian

Dwyana Zaraswati, dkk. 2011. Mikroobiologi Dasar. Universitas Hasanuddin. Makassar  

Dwyana Zaraswati, dkk. 2012. Penuntun praktikum Mikroobiologi. Universitas Hasanuddin. Makassar

Firebiology. 2009. Teknik Pewrnaan Mikroorganisme. www.wordpress.com.   Diakses pada tanggal 15 Januari 2012. Campalagian

Surya. 2009. Pengamatan Morfologi. Bakteri.  www.blogspot.com.  Diakses pada tanggal 15 Januari 2012. Campalagian

Qhiqhie. 2010. Pewarnaan Bakteri. www.blogspot.com. Diakses pada tanggal 15 Januari 2012. Campalagian